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人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒

本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體中人Ki-67蛋白(Ki67P)含量。

 檢測范圍

0.313-20ng/mL

 *低檢測限

0.117ng/mL

 實驗原理

將人Ki-67蛋白(Ki67P)抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的人Ki-67蛋白(Ki67P)與連接于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的人Ki-67蛋白(Ki67P)抗體，將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標記的親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人Ki-67蛋白(Ki67P)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(O.D.值)，計算樣品濃度。

 試劑盒內容

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒需自備的設備及試劑

1.         450±10nm濾光片的酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)

2.         單道或多道微量加液器及吸頭

3.         稀釋樣品的EP管

4.         蒸餾水或去離子水

5.         吸水紙

6.         盛放洗液的容器

 試劑盒的儲存及有效期

1.         未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將TMB 洗滌液，終止液保存于4℃，其他試劑保存于-20℃。

2.         使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存，開封后的酶標板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。

注意：

試劑盒內酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在**實驗后 1個月內使用完畢。產品過期時間以盒子上的標簽為準，保質期內所有組分都確保是穩定的。

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒標本的采集與保存

1.         血清：

將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4^oC 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20^oC 或-80^oC 保存，但應避免反復凍融。

2.         血漿：

用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內于 2-8^oC 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20^oC 或-80^oC 保存，但應避免反復凍融。

3. 組織勻漿：

1） 取適量組織塊，于預冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；

2） 可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預冷PBS 進行充分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融 進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復2 次）。

3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測。

4. 細胞裂解液：

1）貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞（懸浮細胞可直接離心收集）；

2）將收集到的細胞用冷PBS 洗3 次；

3）物理方法裂解細胞（可先超聲破碎細胞，再反復凍融）：

i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。

ii 反復凍融：將待破碎的細胞在-20 ^oC 以下冰凍，室溫融解，反復3 次，使細胞溶脹破碎。

4）將標本于2-8 ^oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。

5. 細胞培養上清或其它生物標本：

請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20^oC 或-80^oC 保存，但應避免反復凍融。

注意：

1.         以上標本均需密封保存，4^oC保存應小于1周，-20^oC不應超過1個月，-80^oC不應超過2個月。

2.         標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。

3.         實驗前紅細胞裂解液必須用標準品稀釋液稀釋。

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒試劑準備

1.         使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC溶解。

2.         標準品(凍干品)：每瓶標準品加入標準品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為20ng/mL。準備7個稀釋標準品的EP管，每個EP管中加入150μL的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成不同的梯度， 標準品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

3.         濃洗滌液：用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL，進行30倍稀釋。

標本處理

1.         本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

2.         實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

3.         若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。

4.         使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致  ELISA實驗結果偏差。

5.         若樣本為細胞培養上清，因該類樣本干擾因素 較多，如：細胞狀態、細胞數量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

6.         某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。

7.         建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導致實驗結果偏差。

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒操作步驟

1.         加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品*終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

2.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

3.         配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

4.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

5.         加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

6.         溫育：操作同3。

7.         洗滌：操作同5。

8.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

9.         終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

10.     測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

注意：

1.         試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2.         加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，**個孔與*后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)*好控制在10分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。

3.          溫育：為防止樣品蒸發，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4.         洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響*后的酶標儀讀數。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。

5.         反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘觀察一次)，如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。

6.         底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.         如果實驗室內濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。

 實驗流程

1.         實驗前標準品、試劑及樣本的準備；

2.         加樣（標準品及樣本）50μL，37℃孵育30分鐘；

3.         洗板5次，加酶標試劑50ul，37℃孵育半小時；

4.         洗板5次；加入顯色液A，B各50ul,37℃孵育顯色15分鐘

5.         加終止液50μL，立即450nm讀數。

6.    計算

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒計算

各標準品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖(七點圖)，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標(或對數坐標)，O.D.值為橫坐標(或對數坐標），繪出標準曲線(*佳方程式應依回歸方程計算的R2值來定，以R2值越趨近于1為好)。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.30，根據樣品O.D.值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與O.D.值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

 特異性

本試劑盒用于檢測人Ki-67蛋白(Ki67P)，經檢測與其它相似物質無明顯交叉反應。

由于受到技術及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關或相似物質交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經檢測的其它物質有交叉反應。

 精密度

精密度用樣品測定值的變異系數CV表示。CV(%) = SD/mean×100

批內差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測,每份樣本連續測定20 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復測定8次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內差： CV<10%

批間差： CV<12%

人Ki-67蛋白(Ki67P)ELISA試劑盒穩定性

經測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。